那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于蛋白質(zhì)純化方法經(jīng)典攻略（二）：
初始樣品制備
無(wú)論目標(biāo)蛋白的來(lái)源如何，作為純化的初始步驟，原始樣品的制備很重要。同時(shí)也需要考慮表達(dá)和純化策略。
目標(biāo)蛋白的胞外分泌可使用簡(jiǎn)單快速親和純化方案；所需的唯*一樣品制備可能需要傾倒貼壁細(xì)胞的條件培養(yǎng)基或者低速離心以去除懸浮細(xì)胞。當(dāng)然，制備過程的**步色譜層析時(shí)可能需要加入蛋白酶抑制劑或者調(diào)節(jié)pH，但這些步驟簡(jiǎn)單易行。然而，如果**步純化樣品步驟進(jìn)行離子交換，樣品則可能需要首先脫鹽。當(dāng)處理大量條件培養(yǎng)基時(shí)可能會(huì)有技術(shù)難度；根據(jù)培養(yǎng)基的脫鹽體積?？刹捎猛肝龌蝈e(cuò)流過濾。
如果靶蛋白在胞內(nèi)表達(dá)，則細(xì)胞首先需要通過離心獲取，然后用合適的裂解緩沖液重懸。如上所述，裂解緩沖液需要包含合適的緩沖液和其它添加劑以確保靶蛋白的*大穩(wěn)定性。如果研究者在柱層析之前避免耗時(shí)的緩沖液交換步驟，則樣品/裂解緩沖液的組成也需與隨后的純化步驟相適宜。
接下來(lái)，需要有效的細(xì)胞裂解方法。大腸桿菌可以通過弗氏壓碎器裂解（盡管這種方法不容易規(guī)?；?，超聲或基于洗滌劑的裂解（有很多商業(yè)裂解試劑）。通過向裂解緩沖液中加入溶菌酶可以改善基于洗滌劑的裂解效率?；谙礈靹┑牧呀夥浅睾?，且不導(dǎo)致細(xì)*菌DNA的顯著切變。因此，為了降低樣品粘度產(chǎn)生具有良好流動(dòng)特性的樣品，通常需要加入含DNA酶（高純度制劑可商購(gòu)）。
哺乳動(dòng)物和昆蟲細(xì)胞也可以通過超聲或基于洗滌劑的方法裂解。如果核膜顯著裂解，可能需要DNA酶處理降低樣品粘度。
一旦細(xì)胞（微生物/昆蟲/哺乳動(dòng)物）被裂解，通常需要離心除去細(xì)胞碎片（通常在4℃下15000×g離心15分鐘，以避免色譜柱堵塞）。所得上清液即可開始用于靶蛋白的柱色譜層析純化。 柱層析的基本原理是將一份蛋白質(zhì)混合物分成很多小份，從而使某些組分中目標(biāo)蛋白的濃度通過濃縮得以增大。雖然已經(jīng)有很多昂貴和特殊的設(shè)備可用于柱層析，但實(shí)際上它只需要*基本的設(shè)備即可。
基本柱層析設(shè)備1、固定相：一種惰性介質(zhì), 通常帶有一種可促進(jìn)蛋白質(zhì)相互作用的官能團(tuán)以進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。固定相和官能團(tuán)的選擇取決于層析色譜和方法的種類。
2、柱子：一種圓柱形玻璃容器，長(zhǎng)度和直徑各不相同。柱子可以直接購(gòu)買已填裝固定相能直接連接到層析設(shè)備上使用的預(yù)裝柱，或可購(gòu)買空柱自己手動(dòng)填裝。自動(dòng)層析設(shè)備和人工重力柱使用的是不種類型的柱子。
3、溶劑：含有添加劑的緩沖液，作為將蛋白質(zhì)在固定相上平衡和洗脫的流動(dòng)相。不同類型的柱層析需要不同的溶液條件。
4、收集管：用于收集洗脫液樣品的容器。自動(dòng)組分收集器需要特定的收集管。手動(dòng)收集時(shí)，則試管或容器均可使用。
5、純度檢測(cè)方法：一種檢測(cè)樣品里所有蛋白質(zhì)中目標(biāo)蛋白相對(duì)含量的檢測(cè)手段。每一步獲得的含有目標(biāo)蛋白的組分都必須在進(jìn)行下一步純化工作前進(jìn)行檢測(cè)。后面的章節(jié)將對(duì)一些常用的純度分析方法進(jìn)行討論。 柱層析可以依賴用泵將溶劑以固定流速打入填裝好的層析柱的自動(dòng)設(shè)備來(lái)完成或者依靠流動(dòng)相的重力作用自己完成。自動(dòng)系統(tǒng)或者重力柱系統(tǒng)均可與自動(dòng)組分收集器連接使用。

系統(tǒng)類型	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
自動(dòng)	設(shè)備自動(dòng)運(yùn)行 常連接一臺(tái)吸光度檢測(cè)器 可程序設(shè)定平衡和洗脫步驟 可輕松設(shè)定梯度洗脫 重復(fù)性好	需要配套特定、昂貴的設(shè)備 *大流速受層析柱壓力限限制
重力流	便宜 操作者可控性更強(qiáng) 運(yùn)行過程中可隨時(shí)調(diào)節(jié)	更依賴人工 流速受重力作用限制

表三：蛋白質(zhì)分離柱層析系統(tǒng)

親和層析

親和層析主要依靠蛋白質(zhì)與介質(zhì)配體間特異性的可逆結(jié)合作用進(jìn)行分離。配體可直接與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，也可以與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽結(jié)合。親和層析通常是一種*粗放的純化過程，一般在純化工藝的前期應(yīng)用?；诤罄m(xù)應(yīng)用的要求，可能只需要一步親和層析即可獲得純度合格的蛋白質(zhì)。
親和層析的固定相是一種共價(jià)結(jié)合特異性配體的惰性介質(zhì)，該配體可與一個(gè)蛋白質(zhì)或一類蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。惰性介質(zhì)通常是交聯(lián)的瓊脂糖或者聚丙烯酰胺。蛋白質(zhì)可采用選擇性或非選擇性模式來(lái)進(jìn)行親和柱層析純化。在選擇性親和柱層析中，一般使用對(duì)蛋白質(zhì)有特異性作用的配體或共價(jià)結(jié)合的標(biāo)簽。在非選擇性親和柱層析中，如用于免*疫球蛋白純化的蛋白A、G、L，用于DNA結(jié)合蛋白的肝素或用于糖蛋白的凝集素等，這些配體與一類蛋白都具有相似的結(jié)合能力。

圖 4. 用蛋白A、G、L進(jìn)行親和層析的原理示意圖：A.抗體含有多個(gè)功能區(qū)：一類蛋白質(zhì)的Fc區(qū)（片段，恒定區(qū)） 都是相同的，F(xiàn)v區(qū)（片段，可變區(qū)）是每個(gè)抗體各不相同的特異區(qū)，F(xiàn)ab（片段，抗原區(qū)）是抗體實(shí)際與特異性抗原結(jié)合的區(qū)域。B.抗體的特異性區(qū)域可以通過親和色譜進(jìn)行非選擇性純化，在該過程中，配體 （蛋白 A、G、L）是結(jié)合在分離介質(zhì)上的。C. 蛋白A、G、L亦可用于純化特異性蛋白。這種情況下，抗體作為中間配體為其抗原提供選擇性。
兩類親和色譜中，在不影響蛋白質(zhì)（或標(biāo)簽） 和配體間作用力的條件下，蛋白質(zhì)均在柱上保留。在不破壞特異性相互作用但可破壞所有雜蛋白與固定相間其非特異性作用的條件下，對(duì)所有結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行淋洗。*后用含有競(jìng)爭(zhēng)分子的緩沖液或者可破壞所有蛋白質(zhì)間相互作用的條件對(duì)結(jié)合蛋白進(jìn)行洗脫。
競(jìng)爭(zhēng)分子可代替目標(biāo)蛋白與配體相結(jié)合。這種競(jìng)爭(zhēng)分子可通過其他層析手段或者透析的方式從目標(biāo)蛋白中去除。通過破壞所有蛋白間相互作用來(lái)從固定相洗脫蛋白的方法包括調(diào)節(jié)緩沖液的pH值或者離子強(qiáng)度。因?yàn)檫@些方法同樣會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，因此通常建議洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)要立即中和或者稀釋以將危害降到*小。有報(bào)道稱，對(duì)于不同形式的親和層析，為獲得*高產(chǎn)率的活性蛋白需采用多種不同的流動(dòng)相條件  。
 

目標(biāo)蛋白	配體伴隨	洗脫
抗體（抗原特異性）	抗原多肽	自由肽
多組氨酸標(biāo)記蛋白	Ni2+ or Co2+	咪唑或游離組氨酸
FLAG標(biāo)記蛋白質(zhì)	FLAG特異性抗體	FLAG多肽或低pH值
GST標(biāo)記蛋白質(zhì)	還原型谷胱甘肽	游離谷胱甘肽
Myc標(biāo)記蛋白質(zhì)	Myc特異性抗體	低pH值
抗體（類型特異性）	蛋白A , G, or L	極端pH值
DNA結(jié)合蛋白質(zhì)	肝素	高離子強(qiáng)度

表五：帶有特異性活性官能團(tuán)（配體）的選擇性和非選擇性親和層析示例及其典型洗脫條件。

總結(jié)自Thermo Fisher Pierce和GE。不同類型層析柱的供應(yīng)商見下，由來(lái)邦網(wǎng)（Labome）基于200余篇文獻(xiàn)調(diào)研給出。
設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，即可在其N端或C端（或在少數(shù)情況下，在結(jié)構(gòu)已知蛋白質(zhì)的柔性環(huán)狀區(qū)域） 引入親和標(biāo)簽以助于純化。
抗體通常是基于抗體與其抗原 （抗體識(shí)別的序列） 間的高特異性相互作用來(lái)進(jìn)行純化。一個(gè)含有抗原的多肽可以與帶有抗體特異結(jié)合位點(diǎn)的介質(zhì)相結(jié)合。降低流動(dòng)相緩沖液的pH值可破壞抗體/多肽間相互作用力，釋放出結(jié)合抗體。商業(yè)上，該方法常用于血清原液中抗體的純化。
蛋白質(zhì)同樣可通過非選擇性方式進(jìn)行親和純化。在非選擇性純化過程中，固定相上結(jié)合的配體可以與一類具有類似結(jié)合部位的蛋白質(zhì)相結(jié)合。DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的純化就是一個(gè)非選擇性親和層析的實(shí)例。因?yàn)楦嗡嘏cDNA的結(jié)構(gòu)和電荷極為類似，它可以被作為DNA結(jié)合蛋白質(zhì)親和層析的配體。
由于所有的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)理論上都可以與該固定相結(jié)合，幾乎其他所有蛋白質(zhì)都會(huì)穿透而不與介質(zhì)結(jié)合，從而可達(dá)到目標(biāo)蛋白產(chǎn)率*大程度的富集。另一個(gè)例子是抗體通過其恒定區(qū) （Fc）與配體間的相互作用進(jìn)行富集濃縮，蛋白A、G、L都是常用的配體。GE Healthcare的蛋白A親和層析柱 [15-17] 和蛋白G [18] 都是常用的選擇。
當(dāng)采用類似的結(jié)合模式（抗體與蛋白A、 G或 L配體結(jié)合）時(shí)，抗體的抗原結(jié)合區(qū)（Fab）仍然保持與其特異性抗原結(jié)合的能力。因此，特異性蛋白可通過配體/抗體結(jié)合和抗體的抗原間的特異性相互作用來(lái)純化。

常見問題及解決方式見表6。

問題	原因	解決方法
蛋白不結(jié)合	標(biāo)簽未翻譯或不可及	檢查質(zhì)粒序列或?qū)?biāo)簽移到其他位置
	結(jié)合條件不合適	調(diào)節(jié)緩沖液條件
	結(jié)合時(shí)間不夠	降低流速或停止過柱以延長(zhǎng)結(jié)合時(shí)間
蛋白未洗脫出	配體與標(biāo)簽間相互作用過強(qiáng)	增大（特異性） 競(jìng)爭(zhēng)分子濃度或調(diào)節(jié)條件更嚴(yán)格（非特異性）
	蛋白質(zhì)柱上聚集	調(diào)整緩沖液到更利于保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件
低分辨率	流速過慢或過快	調(diào)整流速
	柱子未充分洗脫	用條件更嚴(yán)格的緩沖液淋洗；根據(jù)廠家指導(dǎo)清洗固定相
	蛋白質(zhì)柱上聚集	調(diào)整緩沖液到更利于保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件
	洗脫條件不夠嚴(yán)格	增大（特異性） 競(jìng)爭(zhēng)分子濃度，或調(diào)節(jié)條件（非特異性）
純化過程中蛋白質(zhì)失活	蛋白質(zhì)去折疊或聚集	調(diào)整緩沖液到更利于保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的條件
	保持活性必要的輔因子在純化過程中被除去	添加輔因子

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