那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下磷酸化蛋白WB太難了,踩坑無(wú)數(shù)后我們總結(jié)了這7條:
蛋白磷酸化,是蛋白激酶在靶蛋白的氨基酸殘基上添加磷酸基團(tuán)的一種可逆的翻譯后修飾,也是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究繞不開(kāi)的話(huà)題。
WB 難,一入 WB 深似海,磷酸化蛋白的 WB 檢測(cè)更是難上加難!因?yàn)橐坏┘?xì)胞裂解,就會(huì)釋放出蛋白酶和磷酸酶,可以降解或修飾蛋白質(zhì),從而影響檢測(cè)結(jié)果。怎么搞定?別急,告訴你 7 個(gè)小妙招:
① 將樣品置于冰上,使用預(yù)冷的緩沖液
樣品處理中使用的設(shè)備或緩沖液應(yīng)在冰上(4 ℃)冷藏保存。盡可能使用預(yù)冷的試劑和設(shè)備,可以減緩去磷酸化、蛋白水解和變性。
② 使用磷酸酶抑制劑
在裂解緩沖液中加入磷酸酶抑制劑,否則輕者條帶不明顯,重者沒(méi)有條帶。*好是添加新鮮配制的蛋白酶-磷酸酶抑制劑混和物。
③ 將樣品儲(chǔ)存在上樣緩沖液(loading buffer)中
蛋白定量后,將樣品與上樣緩沖液混合,遏制磷酸酶活性。隨后可以將樣本等分并儲(chǔ)存在冰箱中或加載到凝膠上。
④ 避免使用牛奶作為封閉劑
牛奶中含有大量的一種磷蛋白——酪蛋白,會(huì)引起高背景。建議使用牛血清白蛋白BSA或無(wú)蛋白的封閉劑。
⑤ 使用無(wú)磷酸鹽緩沖液
為盡量減少非特異性信號(hào),用 TBST 代替磷酸鹽緩沖液(PBS)。如果在中間步驟中必須使用 PBS,則應(yīng)在加入蛋白檢測(cè)底物前,用大量 TBST 清洗膜,以除去過(guò)量的磷酸鈉。
⑥ 使用靈敏的底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
如需檢測(cè)一種弱磷酸化的低豐度蛋白,可使用抗體對(duì)蛋白進(jìn)行免*疫沉淀獲得濃縮的蛋白,并在泳道中上樣更多的蛋白,同時(shí)使用高靈敏度的底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。
⑦ 檢測(cè)總蛋白含量
為確定 WB 上信號(hào)的缺失是由于磷酸化效率低還是磷酸化蛋白分離不充分,同時(shí)需要檢測(cè)總蛋白含量。例如,使用配對(duì)抗體檢測(cè)磷酸化和未修飾的蛋白。
以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于磷酸化蛋白WB太難了,踩坑無(wú)數(shù)后我們總結(jié)了這7條。
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