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體外重組蛋白表達的蛋白純化標簽如何選擇
體外重組蛋白表達技術已經滲透到生物學的各個領域。目前,體外重組蛋白表達系統(tǒng)主要有四類:原核表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞表達、酵母表達系統(tǒng)及昆蟲細胞表達。表達的一般實驗包括載體構建-表達鑒定-蛋白純化三大步驟。在構建載體階段,除了一些必要的表達元件,還需要考慮的密碼子優(yōu)化和標簽的選擇。選擇合適的標簽不但有利于蛋白的純化,促進蛋白的可溶性,同時也不能影響蛋白的結構功能和下游應用。感謝使用上海金鵬蛋白純化系統(tǒng)Blupadstart進行蛋白純化分離實驗。
本文詳細介紹了幾種蛋白純化標簽,幫助我們更好的設計實驗。
蛋白純化標簽比較
融合標簽 |
大?。↘D) |
功能 |
是否切除 |
HIS |
0.84 |
有利純化,能純化可溶性/包涵體蛋白 |
標簽小,對蛋白無影響 |
GST |
26 |
增強蛋白可溶性,僅能純化可溶性蛋白,屏蔽毒性蛋白 |
標簽較大,影響較大 |
MBP |
44.4 |
增強蛋白可溶性,屏蔽毒性蛋白 |
NusA |
55 |
增強蛋白可溶性,屏蔽毒性蛋白 |
SUMO |
11.2 |
增強可溶性,屏蔽毒性蛋白 |
表1:各個標簽性能對比表
HIS-Tag(組氨酸標簽)
HIS-Tag蛋白純化的標簽HIS-Tag本身的特性對目的蛋白沒有影響,不會形成二聚體;
- 分子量較小,只有0.84KD,對蛋白的下游應用不會產生影響;
- 免疫原性低,可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫并制備抗體;
- HIS-Tag與細菌的轉錄翻譯機制兼容,有利于蛋白表達;
- 可與其他標簽構建雙標簽表達,可用于多種蛋白表達系統(tǒng),純化條件溫和對蛋白影響較小。
GST-Tag(谷胱甘肽巰基轉移酶標簽)GST-Tag相對分子質量較大,約為26KD,插入在目的蛋白的C末端或N末端,大腸桿菌中常用在N端。GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶。一般選擇GST標簽的目的有兩個,一是提高蛋白表達的可溶性,二是提高蛋白的表達量。蛋白表達純化結束后需根據不同的蛋白應用而確定是否切除標簽,標簽較大,切除與否需根據下游應用考慮。如果要去除GST融合部分,可用位點特異性蛋白酶切除。檢測方法可用GST抗體或表達的目的蛋白特異性抗體檢測。
HIS-Tag由6-10個組氨酸殘基組成,分子量不到0.84KD,,通常插入在目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag是目前原核表達常用的標簽,蛋白純化完之后可以不需切除此標簽,也不會對蛋白產生功能影響。同時,蛋白純化步驟簡便,純化條件溫和,對蛋白也不會產生太大影響。
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