那么下面上海金鵬分析儀器有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析:
一、目的
掌握植物基因組DNA提取的一般方法及注意事項(xiàng)。大分子量DNA分子的酶切分析。
二、原理
十六烷基三乙基溴化胺是一種去污劑,可溶解細(xì)胞膜,它能與核酸形成復(fù)合物,在高鹽溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,當(dāng)降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3
mol/L
NaCl)時(shí),從溶液中沉淀,通過(guò)離心就可將CTAB與核酸的復(fù)合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開(kāi),然后將CTAB與核酸的復(fù)合物沉淀溶解于高鹽溶液,再加乙醇使核酸沉淀,CTAB能溶解于乙醇。
三、試劑與器材
(一)、試劑
1 、DNA extraction :500ml
31.885g sorbitol (山梨醇)
6.05g tris PH8.2 (一般不調(diào))
2、Nuclei lysis buffer: 500ml
100ml 1M Tris PH7.5
100ml 0.25M EDTA
200ml 5M NaCl
10g CTAB
100ml ddH2O
3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽) 500ml
用時(shí),將上述三種溶液按1:1:0.4 比例混勻,加入亞硫酸氫鈉(3.8g/l),65℃預(yù)熱,既為抽提液。
(二)器材
恒溫水浴、研缽、電泳設(shè)備
四、操作步驟
(一)、基因組DNA提取
1 取0.15g左右小麥葉片,在液氮中研磨后放入1.5ml離心管中,加入700ml抽體液(65℃預(yù)熱)混勻,放入65℃水浴中,裂解40-60分鐘,期間溫和混勻幾次。
2 取出裂解好的DNA ,加入700ml氯仿:異戊醇(24:1),猛烈混勻,離心(1000rpm,10分鐘)。
3 取上清于新管中,(不要混入氯仿),加入0.8-1倍預(yù)冷異丙醇,緩慢混勻后,再猛烈混勻,使DNA成團(tuán),-20℃放半小時(shí)以上。
4 將析出的DNA 離心,14000rpm,10分鐘。
5 去掉上清,將沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次,離心 干燥,溶于50ml ddH2O。
(二)、酶切及電泳分析
取四支1.5ml離心管,分別寫(xiě)上標(biāo)記:g/EcoRⅠ(學(xué)號(hào))、g/HindⅢ(學(xué)號(hào))、λ/EcoRⅠ(學(xué)號(hào))和λ/ Hind Ⅲ(學(xué)號(hào))。
前兩支試管加入30 ml基因組DNA。后兩支試管加入3mlλ基因組DNA。
前兩支加入5 ml 10×buffer。后兩支加入2ml 10×buffer。
前兩支分別加入ddH2O 12.5ml,后兩支分別加入ddH2O 13ml
分別加入RNase 1 ml。
前兩支試管分別加入1.5 ml EcoRⅠ和Hind Ⅲ,10000rpm離心20 S混勻。前兩支試管分別加入1 ml EcoRⅠ和Hind
Ⅲ,10000rpm離心20 S混勻。
37℃反應(yīng)4h
0.8%瓊脂糖凝膠電泳(樣品全部點(diǎn)樣)。
觀察記錄并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果
以上就是上海金鵬分析儀器有限公司為大家整理總結(jié)關(guān)于植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析。
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